Können In-vitro-Methoden Tierversuche ersetzen?
Dr. Antje Stolzenburg, Bereichsleiterin Biologische Prüfverfahren bei der HygCen Germany GmbH, über Alternativen der Sensibilisierungsbewertung bei Medizinprodukten
Dr. Antje Stolzenburg
Humanbiologin
Antje Stolzenburg studierte Humanbiologie und promovierte im Bereich der molekularen Genetik. Seit 2019 ist sie bei HygCen Germany GmbH tätig und leitet den Bereich Biologische Prüfverfahren.
Sie begleitet Hersteller von Medizinprodukten bei Fragestellungen rund um Biokompatibilität, biologische Risikobewertung und regulatorische Anforderungen. Besonders wichtig ist ihr, wissenschaftliche Erkenntnisse, regulatorische Erwartungen und produktspezifische Anforderungen zusammenzuführen, um fundierte und praxisnahe Lösungen für die biologische Bewertung von Medizinprodukten zu entwickeln.
- Ziel der Sensibilisierungsbewertung
- Einbindung: ISO 10993-10 in die ISO 10993-1:2025
- Wissenschaftliche Grundlage der heutigen In-vitro-Methoden
- Alternative Methoden
- Was untersucht der kDPRA?
- Wie funktioniert der KeratinoSens™ Assay?
- Was wird beim h-CLAT untersucht?
- Wie sensitiv und zuverlässig sind die Verfahren?
- Müssen kDPRA, KeratinoSens™ und h-CLAT immer gemeinsam durchgeführt werden?
- Grenzen der In-vitro-Sensibilisierung bei Medizinprodukten
- Rolle der chemische Charakterisierung und toxikologische Bewertung
- Rolle der klassischen Tiermethoden wie GPMT und LLNA
- Regulatorische Akzeptanz der In-Vitro-Methoden
- Benötigtes Material für Prüfungen
- Dauer der Prüfungen und weitere Entwicklungen
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Bei der Sensibilisierungsbewertung wird untersucht, ob Bestandteile eines Medizinproduktes eine spezifische Immunreaktion auslösen können. Nach einer erstmaligen Sensibilisierung kann ein erneuter Kontakt zu einer allergischen Reaktion führen. Das Risiko kann vom Grundmaterial selbst ausgehen, aber auch von Additiven, Beschichtungen, Klebstoffen, Farbstoffen oder Rückständen aus Herstellung, Reinigung und Sterilisation. Deshalb reicht es nicht aus, nur den Namen des Werkstoffs zu betrachten. Entscheidend ist das fertige Medizinprodukt in dem Zustand, in dem es klinisch eingesetzt wird.
Die ISO 10993-10:2021 beschreibt die Beurteilung von Medizinprodukten und ihren Bestandteilen im Hinblick auf das Potenzial zur Auslösung einer Hautsensibilisierung. Sie ist damit die zentrale produktspezifische Norm für diesen biologischen Effekt.
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Die ISO 10993-1:2025 bildet den übergeordneten Rahmen für die biologische Bewertung. Sensibilisierung gehört zu den biologischen Effekten, die bei Medizinprodukten mit direktem oder indirektem Körperkontakt grundsätzlich bewertet werden müssen.
Das bedeutet jedoch nicht automatisch, dass immer eine neue Sensibilisierungsprüfung erforderlich ist. Zunächst werden alle vorhandenen Informationen betrachtet, zum Beispiel die Zusammensetzung des Produktes, Herstellungsprozesse, chemische Charakterisierung, vorhandene biologische Daten, klinische Erfahrungen und Informationen zu vergleichbaren Produkten.
Anschließend wird in einer Gap-Analyse beurteilt, ob diese Informationen für die Einschätzung des Sensibilisierungsrisikos ausreichen. Erst wenn relevante Daten fehlen, werden zusätzliche Untersuchungen geplant.
Die ISO 10993-1 beantwortet somit die Frage, warum und in welchem Risikokontext Sensibilisierung bewertet werden muss. Die ISO 10993-10 behandelt die spezifischen Anforderungen für diesen biologischen Effekt.
Entwickle die passende Sensibilisierungsstrategie für dein Medizinprodukt
Wir unterstützen dich dabei, In-vitro-Methoden gezielt auszuwählen, Ergebnisse richtig einzuordnen und chemische sowie toxikologische Daten zusammenzuführen. So entsteht eine wissenschaftlich belastbare Prüfstrategie, die regulatorische Anforderungen berücksichtigt und unnötige Tierversuche reduziert.
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Die Methoden orientieren sich am Adverse Outcome Pathway, kurz AOP, für Hautsensibilisierung. Der AOP beschreibt die biologischen Schritte von der ersten chemischen Reaktion bis zur Ausbildung einer spezifischen Immunantwort.
Der Prozess umfasst vier wesentliche Schlüsselereignisse:
- Eine reaktive Substanz bindet kovalent an körpereigene Proteine.
- Keratinozyten aktivieren zelluläre Stress- und Entzündungswege.
- Dendritische Zellen beziehungsweise entsprechende Zellmodelle werden aktiviert.
- Spezifische T-Zellen werden aktiviert und vermehren sich.
Die derzeit etablierten In-chemico- und In-vitro-Methoden bilden vor allem die ersten drei Schlüsselereignisse ab. Die Verfahren liefern daher unterschiedliche, aber komplementäre Informationen. Genau darauf beruht die Idee, mehrere Methoden innerhalb einer integrierten Bewertungsstrategie miteinander zu kombinieren.
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Die wichtigsten Methoden sind in den OECD-Prüfrichtlinien 442C, 442D und 442E beschrieben.
- OECD 442C umfasst In-chemico-Verfahren zur Untersuchung der Protein- beziehungsweise Peptidreaktivität. Dazu gehören DPRA, kDPRA und ADRA.
- OECD 442D beschreibt Methoden zur Untersuchung der Keratinozytenaktivierung. Hierzu zählen unter anderem KeratinoSens, LuSens, EpiSensA, Epi2SensA und α-Sens. KeratinoSens und LuSens verwenden Luciferase-Reportersysteme. EpiSensA und Epi2SensA untersuchen Genexpressionsveränderungen in rekonstruierten humanen Epidermismodellen.
- OECD 442E umfasst Methoden zur Untersuchung der Aktivierung dendritischer Zellen oder entsprechender molekularer Signaturen. Dazu gehören h-CLAT, U-SENS, IL-8 Luc und GARDskin.
In der praktischen Prüfung von Medizinprodukten stehen bei uns derzeit insbesondere der kDPRA, KeratinoSens und h-CLAT im Fokus, weil diese drei Verfahren unterschiedliche Schlüsselereignisse des AOP adressieren.
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Der kDPRA-Test untersucht, ob und wie stark eine Testsubstanz mit Modellpeptiden reagiert. Damit bildet sie das erste Schlüsselereignis ab, also die kovalente Bindung einer reaktiven Substanz (eines synthetischen Cystein-Peptids) an Proteine.
Die Methode eignet sich insbesondere für definierte chemische Substanzen und kann wertvolle Hinweise auf deren Reaktivität liefern. Bei Extrakten aus Medizinprodukten ist die Interpretation anspruchsvoller, weil diese zahlreiche Bestandteile in unterschiedlichen und teilweise unbekannten Konzentrationen enthalten können.
Schwer lösliche Stoffe, komplexe Gemische oder chemische Interferenzen können die Auswertung begrenzen. Hier bieten sich Vortests zur Löslichkeit an, um das passende Extraktionsmittel zu wählen.
Der kDPRA-Test sollte deshalb bei Medizinprodukten nicht isoliert betrachtet werden. Ihre Aussagekraft steigt, wenn das Ergebnis mit zellbasierten Verfahren sowie den Informationen aus der chemischen Charakterisierung zusammengeführt wird.
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Der KeratinoSens™-Test untersucht das zweite Schlüsselereignis, die Aktivierung von Keratinozyten. Das in der OECD 442D beschriebene Verfahren verwendet ein Luciferase-Reportersystem, das auf die Aktivierung des Keap1-Nrf2-ARE-Signalwegs reagiert.
Parallel zur Reporteraktivität wird die Zellvitalität bestimmt. Diese parallele Betrachtung ist entscheidend, weil eine allgemeine zytotoxische Wirkung nicht als spezifische Aktivierung des sensibilisierungsrelevanten Signalwegs fehlinterpretiert werden darf.
In der praktischen Durchführung spielt deshalb die Konzentrationsfindung eine wichtige Rolle. Der auswertbare Konzentrationsbereich muss eine Beurteilung der Reporteraktivität ermöglichen, ohne vollständig von unspezifischer Zellschädigung (mind. 70% vitale Zellen werden benötigt, MTT Assay) geprägt zu sein.
Bei Medizinproduktextrakten können außerdem Präzipitate, Eigenfarbe, eingeschränkte Löslichkeit oder Wechselwirkungen mit dem Testsystem auftreten. Solche Effekte werden im Versuch durch verschiedene Mechanismen erkannt, dokumentiert und bei der Ergebnisinterpretation berücksichtigt werden.
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Der h-CLAT adressiert das dritte Schlüsselereignis des AOP. Verwendet werden humane monozytäre THP-1-Zellen als Modell für dendritische Zellen.
Nach der Exposition wird durchflusszytometrisch untersucht, ob die Oberflächenmarker CD54 und CD86 verstärkt exprimiert werden. Gleichzeitig wird die Zellvitalität (mind. 50% wird benötigt) bestimmt, damit eine spezifische Zellaktivierung von einer unspezifischen toxischen Reaktion abgegrenzt werden kann.
Der h-CLAT liefert somit eine andere biologische Information als kDPRA oder KeratinoSens. Das macht das Verfahren besonders wertvoll innerhalb einer kombinierten Strategie.
Die OECD 442E beschreibt neben dem h-CLAT auch U-SENS, IL-8 Luc und GARDskin. Diese Methoden untersuchen ebenfalls Aspekte der Aktivierung dendritischer Zellen, nutzen dafür jedoch unterschiedliche zelluläre oder molekulare Parameter.
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Die OECD-Methoden wurden anhand definierter Referenzchemikalien validiert und besitzen dokumentierte Leistungsmerkmale. Eine einzelne Sensitivitätszahl lässt sich jedoch nicht seriös auf sämtliche Medizinprodukte und Medizinproduktextrakte übertragen.
Die tatsächliche Leistungsfähigkeit hängt unter anderem von folgenden Faktoren ab:
- Stoffklasse und Reaktionsmechanismus insb. für Chemikalien,
- Löslichkeit und Stabilität,
- Konzentration relevanter Bestandteile,
- Zusammensetzung des Extraktes,
- Eignung des Extraktionsmediums,
- möglichen Interferenzen,
- validiertem Anwendungsbereich der Methode.
Die Sensitivität ist besonders wichtig, wenn ein Verfahren für eine Screening- oder Ausschlussstrategie eingesetzt wird. Ein falsch-negatives Ergebnis könnte dazu führen, dass ein vorhandenes Sensibilisierungspotenzial übersehen wird. Gleichzeitig können falsch-positive oder nicht eindeutig auswertbare Ergebnisse unnötige Folgeuntersuchungen auslösen.
Deshalb ist die Eignung der Methode für die konkrete Probe wichtiger als ein allgemeiner Prozentwert. Die belastbarste Aussage entsteht meist durch die Kombination komplementärer Methoden und weiterer Produktdaten.
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Nein. Eine obligatorische Dreierkombination für jedes Medizinprodukt würde dem risikobasierten Ansatz der ISO 10993-1 widersprechen.
In der Praxis können zunächst zwei komplementäre Methoden ausgewählt werden, die unterschiedliche Schlüsselereignisse abdecken. Führen beide Verfahren zu einer übereinstimmenden Beurteilung und wird das Ergebnis durch die übrigen Produktinformationen gestützt, kann bereits eine belastbare Evidenz vorliegen.
Sind die Ergebnisse widersprüchlich, methodisch eingeschränkt oder nicht eindeutig, kann eine dritte Methode zusätzliche Informationen liefern. Diese Vorgehensweise entspricht auch der aktuellen HygCen-Planung, nach der zunächst zwei unterschiedliche Sensibilisierungsmethoden vorgesehen und bei abweichenden Ergebnissen gegebenenfalls durch eine dritte Methode ergänzt werden.
Entscheidend ist nicht die Anzahl der durchgeführten Tests, sondern ob die gewählte Strategie das Sensibilisierungsrisiko ausreichend abbildet.
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Die OECD-Methoden wurden überwiegend für definierte Prüfchemikalien entwickelt. Medizinproduktextrakte sind dagegen häufig komplexe Gemische mit teilweise unbekannten Einzelkonzentrationen.
Typische Einschränkungen sind:
- unzureichende Löslichkeit oder Stabilität,
- Zytotoxizität des Extraktes,
- Präzipitate oder Phasentrennung,
- Eigenfarbe oder Fluoreszenz,
- Wechselwirkungen mit Reagenzien oder Messsystemen,
- Verdünnung relevanter Stoffe unter die Nachweisgrenze,
- Stoffklassen außerhalb des validierten Anwendungsbereichs.
Darüber hinaus wird das vierte Schlüsselereignis, die Aktivierung und Vermehrung spezifischer T-Zellen, durch die etablierten OECD-Methoden nicht direkt vollständig abgebildet.
Ein einzelnes negatives In-vitro-Ergebnis schließt deshalb ein Sensibilisierungsrisiko nicht unter allen Bedingungen sicher aus. Die Grenzen der jeweiligen Methode müssen offen dokumentiert und in der Gesamtbewertung berücksichtigt werden.
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Die chemische Charakterisierung nach ISO 10993-18 kann Hinweise auf extrahierbare oder unter Anwendungsbedingungen freisetzbare Bestandteile liefern. Werden bekannte oder potenzielle Sensibilisatoren identifiziert, müssen diese Informationen in die biologische Risikobewertung einbezogen werden. Ein analytisch nicht identifizierter Sensibilisierer gilt allerdings nicht automatisch als nicht vorhanden. Berichtsschwellen, Nachweisgrenzen, Unsicherheiten bei der Identifizierung und die Eignung der verwendeten Analysenverfahren müssen berücksichtigt werden.
Auch die toxikologische Bewertung und die In-vitro-Sensibilisierung beantworten nicht dieselbe Frage. Die chemische und toxikologische Bewertung betrachtet identifizierte Bestandteile und die mögliche Exposition. Die In-vitro-Methoden untersuchen dagegen biologische Schlüsselereignisse in einem Testsystem.
In unserer Laborpraxis zeigt sich daher, dass ein belastbares Gesamtbild meist erst durch die Verbindung von Materialinformationen, chemischer Charakterisierung, toxikologischer Bewertung und geeigneten biologischen Daten entsteht.
Du willst wissen, welche Prüfstrategie zu deinem Produkt passt?
Wir beraten dich bei der Auswahl geeigneter In-vitro-Verfahren und bewerten gemeinsam mit dir chemische, toxikologische und biologische Daten. So findest du frühzeitig heraus, welche Untersuchungen wirklich notwendig sind und wie du deine Prüfplanung effizient gestaltest.
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Der Guinea Pig Maximization Test, kurz GPMT, und der Local Lymph Node Assay, kurz LLNA, sind weiterhin relevante In-vivo-Verfahren. Von einem vollständigen Ersatz für alle Medizinprodukte und alle regulatorischen Zielmärkte kann momentan nicht pauschal ausgegangen werden.
Auch ein In-vivo-Verfahren muss jedoch zur Probe und zur Fragestellung passen. Ein Test ist nicht allein deshalb automatisch geeignet, weil er historisch etabliert ist. So muss beispielsweise beim LLNA begründet werden, weshalb die Methode für das konkrete Medizinprodukt beziehungsweise den untersuchten Extrakt angemessen ist.
Vor einer Tierstudie sollte zunächst geprüft werden, ob das verbleibende Sensibilisierungsrisiko durch vorhandene Daten, chemische Charakterisierung, toxikologische Bewertung und geeignete In-vitro-Verfahren ausreichend beurteilt werden kann.
Das Ziel ist nicht, In-vivo-Methoden grundsätzlich abzuwerten. Sie sollten jedoch nur eingesetzt werden, wenn sie für die verbleibende Risikofrage notwendig und wissenschaftlich geeignet sind.
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In Europa ist die Akzeptanz alternativer Methoden bereits weit fortgeschritten. Für Benannte Stellen ist jedoch nicht allein ausschlaggebend, dass ein Verfahren in einer OECD-Prüfrichtlinie beschrieben ist. Nachvollziehbar dokumentiert werden müssen insbesondere:
- die Eignung für das Produkt und den Extrakt,
- die Auswahl und Kombination der Methoden,
- die Validität der einzelnen Versuche,
- der Umgang mit methodischen Einschränkungen,
- die Interpretation widersprüchlicher Ergebnisse,
- die Einbindung in die biologische Risikobewertung.
Außerhalb Europas können die regulatorischen Erwartungen abweichen. Die OECD-Prüfrichtlinien sind international bekannt, daraus folgt jedoch keine automatische Akzeptanz jeder Teststrategie für jedes Medizinprodukt.
Auch die FDA unterstützt grundsätzlich die Entwicklung von „New Approach Methodologies“ (NAMs). Die öffentlich beschriebenen FDA-Initiativen beziehen sich allerdings auf unterschiedliche FDA-regulierte Produktbereiche. Eine allgemeine automatische Anerkennung jeder In-vitro-Sensibilisierungsstrategie für Medizinprodukte lässt sich daraus nicht ableiten.
Für globale Zulassungen sollten die Zielmärkte deshalb bereits bei der Prüfplanung berücksichtigt werden.
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Der Materialbedarf hängt von der Produktgeometrie, der extrahierbaren Oberfläche oder Masse, den Extraktionsmedien und der ausgewählten Methodenkombination ab.
Als aktuelle Planungsgröße wird bei uns je Einzelprüfung angesetzt:
- kDPRA: 3 × 30 cm² oder 5 g pro Produkt,
- KeratinoSens: 3 × 30 cm² oder 5 g pro Produkt,
- h-CLAT: 3 × 30 cm² oder 5 g pro Produkt.
Diese Mengen gelten jeweils für ein einzelnes Verfahren. Bei einer Kombination mehrerer Methoden muss der Gesamtbedarf projektspezifisch festgelegt werden.
Für eine zuverlässige Planung benötigen wir daher möglichst früh Angaben zu Produktabmessungen, Material, Körperkontakt, klinischer Anwendung und verfügbarer Stückzahl. Bei besonderen Geometrien oder sehr kleinen Produkten kann der tatsächliche Stückbedarf deutlich höher sein, als die Flächenangabe zunächst vermuten lässt.
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Die aktuellen typischen Durchlaufzeiten bei HygCen liegen bei:
- kDPRA: etwa 3 bis 4 Wochen,
- KeratinoSens: etwa 4 bis 6 Wochen,
- h-CLAT: etwa 5 bis 6 Wochen.
Die reine Assaydurchführung ist dabei nur ein Teil des Projektes. Je nach Probe können Extraktion, Löslichkeitsprüfung, Konzentrationsfindung, Vorversuche oder Wiederholungen erforderlich sein. Anschließend folgen Qualitätskontrolle, fachliche Bewertung und Berichtserstellung.
Letztlich gehe ich davon aus, dass der Anteil tierfreier Sensibilisierungsbewertungen weiter steigen wird. Der sinnvollste Weg ist jedoch nicht, einen Tierversuch pauschal durch drei In-vitro-Tests zu ersetzen. Damit würde lediglich eine Checkliste gegen eine andere ausgetauscht.
Die tragfähigere Lösung ist eine produktspezifische Strategie, die die Anforderungen der ISO 10993-10, den Risikomanagementrahmen der ISO 10993-1:2025, die OECD-Methoden und die vorhandenen chemischen sowie toxikologischen Informationen zusammenführt.
Als Prüflabor sehen wir unsere Aufgabe darin, Hersteller nicht nur bei der Durchführung einzelner Assays zu unterstützen. Entscheidend ist, gemeinsam eine wissenschaftlich belastbare Prüfstrategie zu entwickeln, die das Sensibilisierungsrisiko zuverlässig bewertet und Tierversuche auf das tatsächlich notwendige Maß reduziert.
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